1.動物的選擇 可作為免疫用的動物多為哺乳類和禽類,主要有家兔、綿羊、馬、豬、驢、豚鼠和雞等,其中實驗常用家兔、綿羊、雞和豚鼠。選擇動物時要注意以下幾個方面:
a.抗原與動物種系 動物性抗原的免疫原性,隨動物種系遠近而有差別。近緣動物的蛋白質免疫原性弱,反之則強。因此選擇動物時應選用親緣關系較遠的動物。b.免疫血清的用量 所需要的免疫血清,如是經常大量地使用,選擇免疫動物時則應選擇大動物;如所需的免疫血清量不大,則以選擇小動物為宜。c.動物的個體狀態 用于免疫的動物必須是適齡、健壯、無感染的動物。免疫過程中應特別注意營養和衛生管理。注射抗原1個月后,動物仍無良好的抗體反應,或在規定注射日程后抗體效價不高,可再注射l~2次,若仍不佳者立即棄去.
2.抗原制備與接種 制造抗血清,根據產品不同,所用抗原、制法亦有所不同。病毒性抗血清,一般是用本動物的含毒組織作抗原,首先把強毒接種本動物,使其發病,采取其含毒性組織作為抗原,注射于免疫動物。細菌性血清,是用抗原性好的強毒或弱毒菌種,接種于規定培養基內,于
3.血清抗體的檢測 免疫程序接近結束時,測定血清的抗體效價,如果效價已達規定的要求,即可視作免疫成功,開始采血。若經試血,血清效價不合格,則可繼續增加注射抗原次數或劑量,如再試血仍不合格,應將動物淘汰。 測定免疫血清效價是及時掌握采血時機的重要步驟。常用的有環狀沉淀反應(包括抗原稀釋法和抗體稀釋法)和雙向瓊脂擴散試驗。 用瓊脂擴散試驗測定血清效價時,如果在抗原孔與抗體孔之間出現沉淀線者,即為陽性。最高稀釋倍數血清孔出現沉淀線,即為該血清的抗體效價。瓊脂擴散試驗的效價通常比環狀沉淀反應稍低。
4.血清采集與提取 免疫后,經試血,抗體滴度達到要求后可采血。動物采血應在上午空腹時進行,禁食一夜,可避免血中出現乳糜而獲得澄清的血清。不論免疫動物是大動物或小動物,采血方法均分一次放血和多次放血法兩種。
a.一次放血 綿羊或其他大動物可用頸動脈放血,家兔、豚鼠和雞則可通過心臟直接采血。b.多次少量放血法 大動物可通過靜脈采血,家兔、豚鼠和雞等小動物可通過心臟采血。 免疫血清的分離應在無菌條件下進行,并應盡量防止溶血。采血用的器械、容器等用前要進行滅菌,以無菌操作采血,注入斜放的大試管或三角瓶內,待凝固后分離血清,將多份分離出的血清混合,待檢。
5.免疫血清的檢驗 免疫血清的檢驗包括無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗。無菌檢驗按成品檢驗的有關規定進行;安全檢驗通常用體重18~
卵黃抗體
免疫血清和卵黃抗體是緊急預防和早期治療相應傳染病的有效制劑。為了降低成本,增加產量,提高治療效果,對健康母雞進行法氏囊病高度免疫,取其卵黃來防治法氏囊病,不但省去殺雞分離血清的麻煩,而且具有產量高、效果好、價格便宜等優點。現以法氏囊病為例,簡要闡明高免卵黃抗體的制備。 1.制造用雞的選擇 選擇健康的蛋雞,隔離飼養觀察l周后無特殊反應者,方可免疫。
2.疫苗免疫 通常使用組織滅活苗,其制備過程如下: a.制備雞的選擇 選40~50日齡SPF雞,用通過SPF雞傳代的野毒滴鼻、點眼,每只雞接種0.2~0.3ml,在48~72h左右死亡的雞,無菌采集其法氏囊,并作病變觀察,將病變典型的法氏囊低溫保存備用。
b.制苗 取
c.無菌檢驗 取滅活苗0.5ml接種于普通瓊脂斜面及厭氧肉湯培養基各一支,于
d.安全試驗及保護試驗 經無菌檢驗合格的滅活苗,給40~50日齡SPF雞或未經法氏囊疫苗免疫過的健康雞,肌肉注射、滴鼻、點眼、接種0.3~0.5ml,觀察半月,無法氏囊病發生者,可用1:10強毒0.5ml/只攻毒,觀察l0~14天,無發病者為安全有效。
免疫程序 第一次免疫,每只雞肌肉注射lml,經7~10天后進行第二次免疫,每只雞2ml,7天后用瓊脂擴散方法測定卵黃抗體效價,如已達到1:64以上,即可收集高免蛋,如效價不高,可隔7~l0天進行第三次加強免疫。
3.高免卵黃抗體的制備
a.高免蛋的處理 高免蛋用0.1%新潔爾滅溶液浸泡5min,洗滌干凈,放入無菌室晾干備用。
b.分離卵黃 無菌操作,打破蛋殼,分離蛋黃。
c.卵黃勻漿 收集的蛋黃置無菌的組織勻漿器中,加等量滅菌生理鹽水,并按每毫升加入青霉素、鏈霉素各1000單位,硫柳汞1.0/萬,勻漿、過濾,分裝消毒瓶內,
4.高免卵黃抗體的檢驗
a.無菌檢驗 取0.5ml高免卵黃抗體,分別接種于普通瓊脂斜面和厭氧肉肝湯培養基,
b.安全檢驗 取30日齡健康雞10只,每只雞肌注卵黃抗體2ml,觀察5~7天,應無任何不良反應。
c.中和試驗 取30日齡健康雞20只,隨機分成2組。試驗組每只雞皮下或肌肉注射野毒和卵黃抗體(1:10)混合液1ml,觀察飼養10~15天,應全部存活,對照組每只雞皮下或肌肉注射野毒1ml,觀察10~15天,應部分或全部死亡,剖檢后出現典型病變。
d.卵黃抗體效價測定 用瓊脂擴散反應測定,抗體效價應在1:64以上