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葉綠體是植物進行光合作用的細胞器，分布在葉肉細胞內。葉綠體是由被膜、間質和類囊體三部分組成。依據分離所得葉綠體的結構完整程度，大致將葉綠體分成兩類，一類為被膜已破碎的葉綠體，稱之為破碎葉綠體，它具有光合電子傳遞、光合放氧和光合磷酸化的功能；另一類為被膜完整的葉綠體，它具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。下面分別介紹這兩類葉綠體的制備以及被膜完整度的測定。
一、破碎葉綠體的制備 1.器材與試劑 (1) 器材 普通離心機(最好帶有水平離心頭)、研缽或電動搗碎器、分光光度計、冰箱、扭力天平、 pH計、量筒、移液管、離心管、脫脂紗布等。 (2) 試劑 ①提取液 O.4 mol/L蔗糖，O.O5 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，0.01mol/L NaCl(簡稱STN溶液) ②80%的丙酮 2.操作方法 (1)葉綠體制備 取菠菜、豌豆或小麥苗等新鮮葉片，洗凈后去除中脈，置于研缽或搗碎器中，加人冰冷的提取液，每10g葉片約加20m1冰冷的STN溶液。用手工研磨或用電動搗碎器搗碎，使葉片搗碎至碎米粒樣大小，經過4層紗布過濾，濾液先以200×g離心1min，去除粗粒沉淀，上層液再以1000×g離心3min，倒掉上層液，沉淀為葉綠體。用少量STN溶液懸浮葉綠體，懸浮時可用棉球分散沉淀，并通過棉球吸取，以過濾葉綠體結塊，葉綠體懸浮液置于冰浴中備用。 (2)葉綠素濃度測定 取葉綠體懸浮液0.1m1，加4.9 m1 80%的丙酮，搖勻后于1000×g離心2min，上清液置于l cm光徑的比色杯，在波長為652nm處的分光光度計上比色。再按下列公式計算：652nm光密度讀數(OD值)×50/34.5＝葉綠素mg/ml葉綠體懸浮液。 3.注意事項 (1)提取葉綠體操作都在低溫下進行，所用器皿都需預冷。 (2)葉綠體活力會隨著離體時間延長而不斷下降，因此，操作盡可能迅速，分離工作盡可能在短時間內完成。 (3)破碎的葉綠體制劑儲存在液氮中，其Hill反應活性可保持較長時間，儲存時葉綠體的濃度宜濃些(約3～4mg葉綠素/m1)，并加25%體積的甘油。 二、完整葉綠體的制備 分離方法一般有兩種，一是酶消化方法，把葉片表皮撕去后，用纖維素酶和果膠酶消化細胞壁，得到原生質體，再把原生質體通過尼龍網小孔(孔徑20μm)，使原生質體破裂而釋放出完整葉綠體，但此方法分離得到的葉綠體數量有限。另一種是用機械方法，先用搗碎機破碎葉片，再分步離心，可以大量制備葉綠體。這里主要介紹離心法分離完整葉綠體。 1.器材與試劑 (1)器材 普通離心機(需帶有水平離心頭)，或低溫離心機、電動搗碎器、照光裝置、氧電極測氧裝置等。 (2)試劑 ①提取液：含0.33mol/L山梨醇，0.05 mol/L MES (pH 6.1)，0.01 mol/L NaCl，2mmol/L MgC12，2 mmol/L EDTA-Na2，0.5 mmol/L KH2P04，2 mmol/L抗壞血酸鈉(抗壞血酸鈉宜在使用前現配現加) ②漲破葉綠體的Hill反應速率測定液：0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L K3Fe(CN)6。10 mmol/L NH4C1 ③0.66 mol/L山梨醇 ④Percoll(一種具有高密度和低滲透勢的二氧化硅溶膠) 2.操作方法 (1)采摘新鮮菠菜或豌豆葉片 菠菜要選擇嫩而厚，無顯著皺紋的葉片，最好在早晨摘取，以免日照后在葉綠體內積累淀粉，不利于完整葉綠體的分離。豌豆也要選擇嫩而厚的葉片，摘取后應盡快使用。葉片先在強光下照射15～20min，用以激活葉綠體，尤其用在完整葉綠體的以二氧化碳為底物放氧活性測定時，能使其縮短光合作用誘導期。為了防止強光照射下的溫度上升，可把葉片鋪放在冰塊上，并在光源與葉片之間放隔水層。 (2)葉綠體制備 葉片去除葉柄及中脈后，以每10g葉片約加20～30ml冰冷的提取液。在電動搗碎器上高速搗碎，約2s/次，間隔搗碎3～4次，使葉片碎成綠豆粒樣大小，然后經4層紗布過濾，去除殘渣。注意過濾時不可用力擠壓，以免葉綠體被膜破碎。濾液以1000×g離心，將離心管放人離心機后，使離心機的加速很快上升到預定值，經約30s后再很快使其下降停止，整個離心程序大約用2～3min左右完成。小心地倒出上清液，先用少許提取介質漂洗去沉淀表面的浮物，再加入懸浮介質：即把提取介質中的MES換成HEPES(pH7.6)，懸浮葉綠體，在分散葉綠體沉淀時宜使用毛筆輕輕刷之，或者用手握住離心管，在冰塊之間攪動，使葉綠體由于振動而分散開來，不要用棉球吸濾，以防被膜壓破。葉綠體懸浮時要濃一些(含葉綠素2 mg/ml以上)，這樣有利于其活性的保持。 (3)葉綠體被膜完整率的進一步提高 上述方法所得葉綠體被膜完整率一般約在60%左右，好的時候也可達到70%以上。如果需要進一步提純，一種簡單的方法是再次用懸浮介質洗滌葉綠體，并用同樣離心方法沉淀葉綠體，把破碎的葉綠體漂洗去，起著浮選作用，但用此方法提高被膜完整率的程度有限，而且葉綠體損失也多。另一種方法是用Percoll作為密度梯度介質，方法是將3m1含有80% Percoll(以原液為100%濃度，用水稀釋)，鋪在10ml體積的離心管下層，再把3m1 40%Percoll鋪在離心管的中層，然后將lml葉綠體懸浮液輕輕地鋪在離心管的上層，用水平離心頭的離心機在1500×g下離心2～3min，注意此時離心機的加速一定要緩慢上升，而下降時也要緩慢停下，否則會破壞Percoll的濃度梯度層的形成，取出離心管可以看到有3層綠色帶，最上層的為破碎葉綠體，沉在底層的為粗顆粒，而40%～80% Percoll之間的界面上有一綠色層，是完整葉綠體，小心地將它吸取出來，轉移到葉綠體懸浮介質里。此部分葉綠體的被膜完整率可達95%以上，有時甚至100%。Percoll介質可以重復使用，把密度梯度離心用過以后的40%和80% Percoll，分別吸取出來，存儲于冰箱中以備下次使用。如果制備完整葉綠體的目的只是為了供葉綠體DNA的分離所用，則主要獲得被膜完整率高的葉綠體制劑即可，不必考慮葉綠體同化二氧化碳的活性，因此提取介質可改用簡單的STN溶液，但是操作順序需按照制備完整葉綠體的方法，再用Percoll作密度梯度離心提純。 三、葉綠體被膜完整率的測定 由于鐵氰化鉀不能透過葉綠體被膜，故完整葉綠體在等滲條件下不能進行鐵氰化鉀光還原的反應，而被膜破碎的葉綠體，鐵氰化鉀可進入葉綠體進行反應，利用此原理來比較被膜破碎與未破碎葉綠體的Hill反應速率的差別，就可測出葉綠體中被膜的完整率。被膜未破的葉綠體的Hill反應速率測定，是將上述被膜漲破葉綠體的Hill反應速率測定液，先以1：1體積與0.66 mol/L山梨醇混合，使之保持0.33 mol/L山梨醇濃度，再加入葉綠體(每毫升反應液約含葉綠素50μg)，用氧電極方法測定Hill反應速率(參閱氧電極測氧方法)。被膜破碎的葉綠體Hill反應速率測定，是先與不含山梨醇的Hill反應液混合，使被膜在低滲介質下脹破，再以1：1體積與0.66mol/L山梨醇混合，使測定時也保持0.33mol/L山梨醇濃度，在相同條件下測定Hill反應速率。被膜完整率的計算如下： 被膜完整率(%)＝[（被膜漲破葉綠體的Hill反應速率－完整葉綠體的Hill反應速率）/被膜漲破葉綠體的Hill反應速率 ]×100 測定計算實例見下圖：
被膜完整率(%)＝(150－8)/150 ＝94.7% 參考文獻 中國科學院上海植物生理研究所，上海市植物生理學會編，現代植物生理學實驗指南，1999，北京，科學出版社，1一3 《生物生產力和光合作用測定技術》(科學出版社1986) |
