HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法
1、樣品量不足，解決辦法為增加樣品量
2、樣品未從柱子中流出。可根據樣品的化學性質改變流動相或柱子
3、樣品與檢測器不匹配。根據樣品化學性質調整波長或改換檢測器
4、檢測器衰減太多。調整衰減即可。
5、檢測器時間常數太大。解決辦法為降低時間參數
6、檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。
7、檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。
8、記錄儀測壓范圍不當。調整電壓范圍即可。
9、流動相流量不合適。調整流速即可。
10、檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。
為什么HPLC柱柱壓過高
柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。
1、拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；
2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；
3、將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；
4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質，正是這些雜質將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯系。 一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。
液相色譜中峰出現拖尾或出現雙峰的原因是什么？
1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子
如何解決HPLC進行分析時保留時間發生漂移或急速變化
漂移現象
1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定
2、流動相發生變化，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等
3、柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡
快速變化現象
1. 流速發生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定
2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。
3、流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內進行適當混合
HPLC 儀器問題
1、 我的HPLC泵壓明顯的偏高，請問可能的原因？
答：流速設定過高；流動相或進樣中有機械雜質，造成保護柱、柱前篩板或在線過濾器阻塞；流動相粘度過大；柱溫過低；緩沖鹽結晶；壓力傳感器故障。
2、 基線不穩，上下波動或漂移的原因是什么，如何解決？
答：a.流動相有溶解氣體；用超聲波脫氣15-30分鐘或用充氦氣脫氣
b.單向閥堵塞；取下單向閥，用超聲波在純水中超20分鐘左右，去處堵塞物
c.泵密封損壞，造成壓力波動；更換泵密封
d.系統存在漏液點；確定漏液位置并維修
f.柱后產生氣泡；流通池出液口加負壓調整器
g.檢測器沒有設定在最大吸收波長處；將波長調整至最大吸收波長處
h.柱平衡慢，特別是流動相發生變化時；用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。
3、 接頭處為何經常漏液，如何處理？
答：接頭沒有擰緊；擰松后再緊，手緊接頭以手勁為限，不要使用工具，不銹鋼接頭先用手擰緊，再用專用扳手緊1/4-1/2圈，注意接頭中的管路一定要通到底，否則會留下死體積。接頭被污染或磨損；建議更換接頭。接頭不匹配，建議使用同一品牌的配件。
4、 進樣閥漏液是如何造成的？
答：a.轉子密封損壞；更換轉子密封
b.定量環阻塞；清洗或更換定量環
c.進樣口密封松動；調整松緊度
d.進樣針頭尺寸不合適，一般是過短；使用恰當的進樣針（注意針頭形狀）
e.廢液管中產生虹吸；清空廢液管
譜圖問題
1、 問：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？
答：a.篩板阻塞；反沖色譜柱、更換進口篩板
b.色譜柱塌陷；填充色譜柱
c.有干擾物質的存在；使用更長的色譜柱、改變流動相或更換色譜柱
e.流動相PH值不合適；調整PH值，對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰
f.樣品與填料表面的溶化點發生反應；加入離子對試劑或堿性揮發性修飾劑或更改色譜柱
2、 問：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？
答：保護柱或分析柱污染；取下保護柱再進行分析。如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強保留物質污染，運用適當的再生措施。如果問題仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。樣品溶劑不溶于流動相；改變樣品溶劑，如果可能采取流動相作為樣品溶劑。
3、 問：K值增加時，拖尾更嚴重，這是為什么？
答：反相模式，二級保留效應；
a.加入三乙胺（或堿性樣品）
b.加入乙酸（或酸性樣品）
c.加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品）
d.更換一支柱子
4、 問：保留時間的波動有幾種可能的原因？
答：溫控不當；調節好柱溫。流動相組分變化；防止流動相蒸發、反應等，做梯度時尤其要注意流動相混合的均勻。色譜柱沒有平衡；在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。
液相色譜常用符號與術語表
ACN 乙腈 Acetonitrile
AUFS 滿量程的吸光度單位 Absorbance units, full scale
As 峰不對稱因子
B 二元流動相中的強溶劑；例如：反相HPLC的甲醇/水混合液中的甲醇
BSA 牛血清白蛋白（一種蛋白質） Bovine serum albumin
CAF 咖啡因（中性溶質） Caffeine
CRF 色譜響應因子 Chromatographic response function；色譜圖總分離度的定量指標
dc 色譜柱內徑（cm）
DMOA 二甲基辛胺 Dimethyloctylamine
DNB 2,4-二硝基甲酰（基） 2，4-Dinitrobenzoyl
dp 色譜柱填料的粒度（cm）
DRYLAB 液相資源公司（LC Resources INC.)的計算機模擬軟件。DRYLAB I用于等度預測，DRYLAB G用于梯度預測
F 流動相的流速（ml/min）
FC-113 1，1，2-三氟-1，2，2-三氯乙烷
GPC 凝膠滲透色譜法 Gel-permeation chromatography
HA 酸性溶質，能電離出A-
Hex 己烷 Hexane
Hr 二相鄰譜帶之間的谷高
HVA 高香草酸 Homovanillic acid
h’ 峰高
h1,h2 相鄰譜峰1和譜峰2的峰高
IEC 離子交換色譜法 Ion-exchange chromatography
IP 離子對 Ion-pair
IPC 離子對色譜法 Ion-pair chromatography
J 色譜峰強度參數
K’ 所給譜峰的容量因子，k’=(tR-t0)/t0=tR’/t0，tR=t0(1+k’)
k 梯度洗脫過程中，某溶質的k’的平均值或有效值
kw 以水做流動相k’的外推值
k1,k2 相鄰譜峰1和譜峰2的容量因子
L 色譜柱長度（cm）
Lc 檢測器流動池光路的長度（cm）
M 溶質的分子量
MC 二氯甲烷 Methylene chloride
MDST 混合設計統計技術 Mixture-design statistical technique；一種優化流動相的軟件
MeOH 甲醇 Methanol
MTBE 甲基叔丁醚 Methyl-t-butyl ether
MW 溶質的分子量
N 色譜柱塔板數
NAPA N-乙酰普魯卡因胺 N-Acetylprocainamide（堿性溶質）
N0 檢測器的基線噪音
ODS 十八烷基硅烷 Octadecylsilyl
P 色譜柱的壓力降[通常以巴（bar）表示，也用psi；另外，也用作柱極性參數
PA 普魯卡因胺 Procainamide（堿性物質）
PAH 聚芳香烴 Polyaromatic Hydrocarbon
PESOS 優化流動相的計算機軟件（美國Perkin-Elmer產品）
pKa 溶質酸性常數的負對數；當pH=pKa時，溶質中有一半是電離的
Rk 保留值范圍，Rk=（最末譜峰k’）/（最初譜峰k’）
RRM 相對分離度圖（通常N=10000）
Rs 相鄰二譜峰的分離度
S 當流動相中的%B改變時，測量溶質保留值的變化速率的參數
SAL 水楊酸 Salicylic Acid
SEC 尺寸排阻色譜法 Size-exclusion chromatography
S/N 信噪比 Signal to noise ratio
t 分離時間（min）（樣品進樣時t=0）
tp 梯度系統的滯后時間（min）
TBA 四丁基銨離子 Tetrabutylammonium ion
TEA 三乙胺 Triethylamine
THF 四氫呋喃 Tetrahydrofuran
tk 在用于校正等度洗脫溶劑強度的流動相離開梯度混合器時，梯度洗脫的時間
TLC 薄層色譜法 Thin-layer chromatography
TMA 四甲基銨 Tetramethylammonium（鹽）
TMS 三甲基硅烷 Trimethylsilyl
tO 色譜柱的死時間（min）
tR 溶質的保留時間（min）
tG 梯度時間（min），即梯度開始至結束的時間
t1,t2 相鄰譜峰1和譜峰2的保留時間（min）
ti 色譜圖中第一峰的保留時間（min）
tf 色譜圖中最末峰的保留時間（min）
△tg tf-ti
tx (tf-ti)/2
UV 紫外光
Vm 色譜柱的死體積（mL），Vm=t
VMA 香草扁桃酸 Vanillymandelic acid
wm 化合物的進樣量
w1,w2 相鄰譜峰1和譜峰2于半峰高處（W1/2）的寬度（min）
W1,W2 相鄰譜峰1和譜峰2的基線寬度（min）
W1/2 半峰高處的譜帶寬度
xd,xe,xn 溶劑選擇參數，分別用于測定溶劑的酸度、堿度和偶極性的程度
? 分離因子，?=k2/k1
△? 梯度洗脫期間流動相成分的變化
?o 溶劑強度參數
? 化合物的克分子吸收系數
? 流動相的粘度（Pa?s)
? 流動相中強溶劑的體積份數
%B 二元流動相中強溶劑的體積百分比（%v）
液相色譜法簡介
氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結果，而必須由已知標準作對照定性。當無純物質對照時，定性鑒定就很困難，這時需借助質譜、紅外和化學法等配合。另外大多數金屬鹽類和熱穩定性差的物質還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。在經典液相色譜的基礎上，引入了氣相色譜的理論與技術，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個樣品往往長達幾小時至幾十小時，因此工作效率很低。人們曾對這種經典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時間，但是結果失敗了。根據液相色譜理論，因為隨著載液（流動相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會顯著降低。隨著生產技術的提高，人們制成了細小（<10?m）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達到1~10mL/min。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術和計算機技術的應用，70年代以業逐步實現了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現代液相色譜，以區別于經典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。
高效液相色譜所用基本概念：
保留值等色譜分析有關術語，以及分配系數、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率議程H=A+B/?+C?。式中：縱向擴散項（分子擴散項）B/?對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動相中的擴散系數Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略不計。于是影響液相色譜的主要因素是傳質項Cu。由圖14—可知，氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權數種，其性質差別也不大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多，性質差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要，并且在選擇流動相對應注意以下幾點：流動相對樣品有適當的溶解度，但不與樣品發生化學反應，也不與固定液互溶；流動相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進雜質和組分在流動相中擴散系數下降；流動相應與所用檢測器相匹配，不應對組分檢測產生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點，還由于它的流動相（載液）種類比氣相色譜的流動相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相，從機時可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結構提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點，它適于分離、分析沸點高、熱穩定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質占化合物總數的75~80%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無機鹽類的分離和分析。但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和易揮發物質的分析方面也遠不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補短，相輔相成。
1.分離原理
凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內填充具有一定大小孔穴的凝膠。當樣品進入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖14—2中以黑點表示）隨流動相沿凝膠顆粒（圖14—2中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動相沖洗出來。中等體積的分子產生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個平衡過程而較晚地被流動相沖洗出來。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱，從而實現分離目的。光凝膠色譜采用水溶液作流動相進，稱為過濾凝膠色譜（HFC），而用有機溶劑為流動相時，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。
2．固定相
凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質，是一種經過交聯而具有立柱網狀結構的多聚體。根據凝膠的交聯程度和含水量的不同，分了軟質、半硬質和硬質三種。軟質凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于
3．流動相
在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數相差大的流動相。常用的流動相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。
高效液相色譜儀操作步驟
高效液相色譜儀操作步驟：
1)、過濾流動相，根據需要選擇不同的濾膜。
2)、對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)、打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統。
4)、進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)、有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10 ml/min。
6)、調節流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。
7)、設計走樣方法。點擊file，選取select users and methods，可以選取現有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。
8)、進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數據和做標記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。
9)、關機時，先關計算機，再關液相色譜。
10)、填寫登記本，由負責人簽字。
注意事項：
1)、流動相均需色譜純度，水用
2)、柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3)、所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
4)、壓力不能太大，最好不要超過2000 psi。